El cDNA de buena calidad es clave para experimentos de qPCR, clonaje o preparación de librerías de NGS. Hemos reunido cinco consejos para ayudarlo a aprovechar al máximo sus reacciones de transcripción inversa en sus experimentos:

Preparación de una muestra de RNAde buena calidad

  • Asegure un RNA de alta pureza (A260/A280> 1.8 y A260/A230> 2.0) utilizando los reactivos de Macherey Nagel mediante el método deseado: purificación en columna, Nucleozol o perlas magnéticas.
  • Opcionalmente, se puede comprobar si el RNA esta degradado mediante electroforesis en gel de agarosa

Eliminar el DNA genómico (gDNA)

  • Hay que eliminar el gDNA contaminante en la muestra mediante digestión con DNasa para evitar la degradación del cDNA en los pasos posteriores.
  • Para asegurar que sus muestras de RNA no tengan niveles detectables de gDNA contaminante se puede realizar una PCR o qPCR con una muestra de DNA positiva como control.

Elija la transcriptasa inversa correcta

  • Dependiendo de la aplicación es posible que necesite una enzima con características específicas. Por ejemplo, para preparar transcripciones cortas de cDNA para qPCR, las RTasas de AMV pueden ser las apropiadas.
  • Se puede seleccionar la RTasa en función de su temperatura de reacción óptima, la complejidad de la plantilla o por su sensibilidad a bajo número de copias.
  • Para proteger la integridad del RNA, incluya una un inhibidor de RNasa a su mix de síntesis de cDNA.

Elija la mejor estrategia de cebado según su aplicación:

  • qPCR o preparación de librerías - es primordial obtener un número representativo de cadenas de cDNA, por lo tanto, se recomienda utilizar cebado mixto con hexámeros aleatorios y cebadores oligo-dT. Recomendamos el kit de síntesis de cDNA UltraScript 2.0 cDNA y  FastGene Scriptase II OdT
  • Clonación o cuantificación de un solo transcrito específico – tener la cobertura completa de la transcripción es más importante que la representación, por lo tanto, elija oligo-dT, o cebadores específicos de genes (GSP). Recomendamos el kit de síntesis de cDNA UltraScript 2.0 cDNA Separate Oligos y FastGene Scriptase.

Optimizar las condiciones de reacción.

    • Asegúrese de que su plantilla de RNA esté completamente desnaturalizada antes de que comience la síntesis de la primera hebra incubando el RNA y los cebadores en el tampón de reacción a 70 ° C durante 5 minutos y luego enfríe rápidamente colocándolos directamente en hielo antes de agregar RTasa (e inhibidor de RNasa si está separado).
    • Hay que identificar el tiempo de incubación óptimo para que la RTasa sintetice el cDNA de primera hebra de longitud completa. Esto puede incluir aumentar el tiempo de incubación más allá del recomendado por el fabricante de la enzima.
      Equipos de PCR y qPCR
      Polimerasas
      Tips & Tricks